18101056239
更新時間：2021-10-22
點擊次數：2816
研究背景
如今，人類正遭受著嚴重的癌癥發病，而且發病率還在不斷增加。目前，治療腫瘤的主要方法有手術，化療，放療(RT)，基因治療(GT)，光動力療法（PDT），光熱療法(PTT)、免疫療法或多模式協同癌癥治療。PDT是一種美國FDA批準的新興療法，PDT在光激活下通過光敏劑(PS)產生活性氧(ROS)，產生細胞毒性殺死癌細胞，具有微創和良好療效的優點?；诓煌墓饣瘜W機理，PDT分為兩類：I型PDT和II型PDT。I型和II型PDT均涉及PS的活化從基單線態到激發單線態，然后到電子激發三線態。對于報道最多的II型PDT過程，激發三線態可以將三線態氧(3O2)轉化為細胞毒性單線態氧(1O2)。然而，由于腫瘤組織的快速繁殖，對氧氣（O2）的需求遠遠超過了O2的供應，從而導致血管系統的異常生長，從而阻礙O2的擴散并導致缺氧的惡性循環。因此，缺氧最初普遍存在于實體瘤中。不幸的是，II型PDT系統高度依賴于O2濃度并涉及O2的急劇消耗，這加重細胞內缺氧，反過來抑制PDT的治療效果。
為了解決這個問題，O2自供方法被廣泛用于提高腫瘤中O2的濃度。一種直接的方法是利用全氟化碳和金屬有機框架(MOF)等O2存儲材料將O2輸送到腫瘤細胞中。另一種通用策略是通過催化原位產生O2以緩解缺氧。報道的催化劑包括*酶、MnO2、鉑（IV）二疊氮配合物、Pt納米酶、MnFe2O4、氮化碳等。然而，由于惡性腫瘤存在嚴重缺氧，補充O2對II型PDT的效果仍然較差。與II類方法不同，I類反應由PS和底物通過氫或電子轉移過程直接激活的反應組成，通常產生羥基自由基(•OH)或超氧自由基(O2?)。到目前為止，一些納米結構包括ENBS-B、LiYF4@SiO2@ZnO、TiO2-釕、Ce-UCNPs、金-銅硫化物蛋黃殼納米粒子、環金屬化Ru(II)配合物和Ti-TBP MOF常被應用，表明I型PDT在缺氧條件下非常有效。此外，缺氧尤其有害，不僅能顯著增加對II型PDT等療法的抵抗力，還能引發致癌轉化，給癌癥治療帶來很大困難。近期研究表明腫瘤缺氧可降低10-11易位活性從而導致DNA高甲基化，而高甲基化經常抑制腫瘤抑制基因的表達，從而促進腫瘤進展。另一份報告表明，缺氧會促進缺氧誘導因子(HIF)的穩定表達，在缺氧癌細胞中產生的HIF蛋白被認為會加速腫瘤發生。因此，克服缺氧是癌癥治療中非常關鍵的問題。另一個關鍵問題是谷胱甘肽(GSH)的過度表達在腫瘤中廣泛存在，過量的GSH會顯著降低在癌癥治療過程中ROS的細胞毒性，從而降低PDT的療效。迄今為止，解決這個問題的通用策略包括使用納米材料進行細胞內氧化反應以降低細胞內GSH水平。
作為一種新興的多孔材料，MOFs被廣泛應用。尤其是具有特征成分的雜化材料易于功能化，是治療癌癥的候選材料。最近，Tang等人報道了使用以CuII為活性中心的Cu(II)基卟啉MOF吸附細胞內GSH以增強PDT。然而，研究人員并未考慮缺氧對PDT的嚴重阻礙。此外，CuII位點與巰基的結合能力不如CuI強。受這一觀察的啟發，該研究設計了一種生物相容性和可生物降解的載氧CuTz-1@F127（表示為CuTz-1-O2@F127）MOF治療系統，通過同步緩解細胞內缺氧和降低腫瘤中的GSH水平來增強PDT。值得注意的是，此前并沒有同時克服缺氧和降低細胞內GSH的報道。首先，CuTz-1 MOF可以作為光活化光敏劑(PS)，即在*(H2O2)存在下產生羥基自由基(•OH)和O2，即I型PDT，如方案1所示。此外，CuTz-1@F127可以攜帶O2分子進入癌細胞并吸附細胞內GSH，同時緩解缺氧和GSH過表達，可以大大提高PDT的療效。外部F127可以增強CuTz-1-O2的生物相容性。尾靜脈（i.v.）注射后，CuTz-1-O2@F127由于增強的滲透性和EPR效應可以在腫瘤中積累，并且NPs在NIR照射下通過協同作用顯示出較高的抗腫瘤功效。此外，CuTz-1-O2@F127制備簡單，避免了一些復雜的程序，賦予了單一MOF材料的多功能性。更重要的是，CuTz-1-O2@F127 NPs具有高度的生物相容性和生物降解性。生物分布和代謝實驗表明，早期CuTz-1-O2@F127 NPs主要在肝臟和脾臟中積累，然后隨著CuTz-1-O2@F127 NPs的降解，通過糞便和尿液排出體外。一個月后，共有近90%的納米顆?？梢酝ㄟ^糞便和尿液排出體外，這對于納米醫學的潛在臨床應用具有重要意義。
方案1
基本信息
題目：Monodispersed Copper(I)-Based Nano Metal–Organic Framework as a Biodegradable Drug Carrier with Enhanced Photodynamic Therapy Efficacy
期刊：ADVANCED SCIENCE
影響因子：16.806
PMID：31406677
通訊作者：逄茂林和林君
作者單位：中科院長春應化所
索萊寶合作產品：
產品名稱 | 產品貨號 |
Reduced glutathione (GSH) assay kit | BC1170 |
摘 要
光動力療法(PDT)已經成為治療癌癥的一種有效方法。然而，PDT的治療效果受到腫瘤中氧氣（O2）供應不足和谷胱甘肽（GSH）過度表達的微環境的嚴重限制。在此，本團隊提出了一種可生物降解的負載O2的CuTz-1@F127金屬有機框架（MOF）治療平臺（表示為CuTz-1-O2@F127），可通過克服細胞內缺氧并降低腫瘤中的谷胱甘肽水平用于增強PDT。這種基于Cu(I)的MOF在近紅外光照射和有H2O2存在的情況下能夠發生類芬頓反應生成•OH和O2。同時，CuTz-1-O2@F127納米顆粒（NPs）可以釋放吸附的O2，進一步緩解細胞內缺氧。此外，CuTz-1@F127中的Cu(I)可以與細胞內的GSH反應，減少過量的GSH。這樣，PDT的效率大大提高。尾靜脈注射后，納米顆粒通過在808nm激光照射下具有很好的協同抗腫瘤效果。更重要的是，NPs是可生物降解的，體內生物分布和代謝實驗表明，近90%的NPs納米材料可在30天內通過糞便和尿液排出，具有很好的臨床轉化前景。
研究內容及結果
1.CuTz-1@F127的合成與表征
據報道，CuTz-1可以表現出類似半導體的行為，并且能夠在H2O2存在下在氙燈照射下發生類芬頓反應生成•OH。圖1a表明，在涂覆F127前后，CuTz-1的形態變化不大。粉末X射線衍射(PXRD)分析(圖1b)證實了納米顆粒的結構。傅里葉變換紅外光譜(FTIR)（圖S3）和熱重分析（TGA）（圖S4）結果證明F127涂層成功。TGA曲線顯示在CuTz-1上有大約10 wt%的F127涂層。此外，分別測量了懸浮在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基中的CuTz-1和CuTz-1@F127的zeta電位、流體動力學大小和多分散指數。如圖1c、d和圖S5所示，涂覆F127后，平均zeta電位值從-5.6±0.3變為-1.2±0.1mV，動態光散射（DLS）數據顯示平均流體動力學尺寸從170.1±11.5增加到186.4±16.7nm，多分散指數從0.27±0.03降低到0.14±0.03，表明CuTz-1@F127顆粒在生理環境中的溶解度和分散性增強。
圖1
2.檢測羥基自由基
•OH的產生首先通過檢測3'-(對氨基苯基)熒光素的熒光增強(APF)，3'-(對氨基苯基)可以選擇性地與•OH反應并變成高熒光。如圖S7所示，在808nm激光照射下，在CuTz-1@F127 PBS溶液中，H2O2存在下觀察到APF熒光明顯增強。接下來，觀察到CuTz-1@F127在激光照射下在H2O2存在的情況下有效降解RhB（圖2a）。而且，DCFH-DA被用于監測細胞內ROS，由于DCFH-DA可以被細胞內的酯酶水解成DCFH，然后非熒光DCFH可以被•OH氧化成綠色熒光的二氯熒光素(DCF)。圖S8表明CuTz-1@F127用808nm激光(0.6 W cm?2)照射10分鐘，細胞內ROS的產生，綠色熒光表明在激光照射下進一步產生了•OH。
3.谷胱甘肽還原的體外研究
考慮到癌細胞中過量的谷胱甘肽會減弱PDT的有效性。該團隊繼續研究CuTz-1@F127是否能降低細胞內GSH。首先，在GSH存在下，CuTz-1@F127保持完整（圖S9）。然后，使用GSH檢測試劑盒測定保留在上清液中的GSH含量。如圖2b所示，雖然GSH分子尺寸大于CuTz-1的孔徑，但CuTz-1@F127在水溶液中與GSH混合后，CuTz-1@F127的BET表面積從184.5 m2g-1下降到 132.7 m2g-1。該小幅下降表明GSH分子與CuI位點結合并占據部分CuTz-1@F127的微孔。元素映射結果（圖2d和圖S11）確認硫元素均勻分布在基體中，進一步證明了CuTz-1@F127可以吸附GSH。此外，為了驗證GSH對•OH氧化能力的影響，在RhB的降解實驗中加入GSH，并引入TiO2（光催化劑）進行比較，如圖2a所示，CuTz-1@F127和TiO2在808nm和氙燈激光照射下對RhB顯示出優異的降解效率。然而，當添加GSH時，TiO2的降解能力嚴重減弱，CuTz-1@F127仍然可以降解近70%的RhB。這個結果表明CuTz-1@F127能有效降低GSH并保持•OH的殺傷力。
圖2
4.氧氣產生的體外研究
值得注意的是，MOFs是O2存儲的良好候選者。該團隊測試了CuTz-1@F127的O2吸附能力。氧吸附-解吸等溫線（圖2e）顯示CuTz-1@F127可以吸附標準大氣壓和室溫下高達400µmol g?1的O2。浸入O2后，得到CuTz-1-O2@F127（圖1a）。為了證明CuTz-1-O2@F127的O2產生和釋放性能，我們測量了808nm激光照射下的O2濃度。如圖2f所示，在低H2O2濃度下，CuTz-1@F127 PBS溶液中觀察到O2濃度增加，表明在類芬頓反應過程中產生了O2。由于在近紅外光輻射刺激下CuI向CuII轉化過程中會產生電子和空穴，可能導致CuTz-1-O2@F127可以釋放癌細胞內吸附的O2，進一步緩解細胞內缺氧。最終，產生和釋放的O2都可以克服細胞內缺氧，這在PDT中起著輔助作用。
5.細胞研究：細胞攝取、生物相容性和光細胞毒性
進一步進行體外實驗研究CuTz-1-O2@F127的抗腫瘤功效。首先，倒置熒光顯微鏡圖像顯示納米顆?？赡苁窃?小時內被4T1細胞（小鼠乳腺癌細胞）內吞（圖S12）。然后，L929細胞（小鼠成纖維細胞）、HeLa細胞和4T1細胞用MTT細胞活力實驗來檢測生物安全性。如圖3a所示，雖然CuTz-1-O2@F127的濃度為高達200×10?6 M，L929細胞的活力在孵育24小時后仍然接近100%，表明CuTz-1-O2@F127對正常細胞具有高度生物相容性。當CuTz-1-O2@F127的濃度超過100×10?6 M時，HeLa和4T1癌細胞的活性降低。這是因為CuTz-1-O2@F127可以吸附細胞內的GSH，并且GSH的減少影響癌細胞的正常生長，導致癌細胞和正常細胞活力的差異。接下來，CuTz-1@F127和CuTz-1-O2@F127與4T1細胞一起孵育，在缺氧和常氧條件下，檢測PDT效果。CuTz-1@F127+光和CuTz-1-O2@F127+光處理后，與4T1細胞孵育24小時，MTT法檢測細胞活力。如圖3b所示，缺氧處理組在光照下表現出比常氧細胞更高的細胞存活率。該結果表明細胞內缺氧促進癌細胞增殖，進一步說明了腫瘤治療過程中克服缺氧的重要性。正如預期的那樣，CuTz-1-O2@F127+光處理組在缺氧條件下的治療效果與常氧條件下相似，并且治療效果隨著CuTz-1-O2@F127濃度的增加而增加。流式細胞術分析（圖S13）進一步證明了CuTz-1-O2@F127+光處理組顯示出低的腫瘤細胞存活百分比（約21.1%）。
圖3
6.ROS和缺氧的細胞內檢測
使用ROS-ID缺氧/氧化應激檢測試劑盒來研究細胞內ROS和缺氧。如圖3c所示，對照組在沒有光照的情況下沒有產生活性氧；然而，在缺氧和常氧條件下，808nm激光照射組均檢測到強ROS信號，表明I型PDT過程即使在缺氧條件下也能產生大量的•OH。此外，近紅外光照射后，CuTz-1@F127+光和CuTz-1-O2@F127+光組在缺氧條件下處理的細胞顯示比未照射的紅色熒光弱，表明CuTz-1@F127在NIR照射下可以在細胞中產生O2，CuTz-1-O2@F127+光組顯示出比CuTz-1@F127+光組更弱的紅色熒光，表明CuTz-1-O2@F127可以進一步釋放它攜帶的O2以緩解癌細胞的缺氧。
圖3
7.活/死細胞染色分析
為了進一步檢查CuTz-1 MOF系統在缺氧條件下的細胞光毒性，通過Calcein-AM/PI雙染試劑盒區分活細胞（綠色熒光）和死細胞（紅色熒光）。如圖3d所示，作為對照組，所有未經處理或用PBS+光、CuTz-1@F127和CuTz-1-O2@F127處理的細胞，細胞均顯示綠色熒光，表明細胞幾乎沒有損傷。在808nm激光照射下，CuTz-1@F127處理組觀察到細胞顯示很微弱的綠色熒光，表明大多數細胞死亡。用CuTz-1-O2@F127+光處理組觀察到細胞顯示紅色熒光，表明細胞均死亡。這些結果進一步表明CuTz-1-O2@F127在克服缺氧以增強癌細胞的PDT方面具有*的治療效果。
8.體內腫瘤抑制能力
隨著PDT效應在體外被廣泛研究和認可，進一步研究了CuTz-1-O2@F127在4T1荷瘤小鼠上體內的治療效果。實驗設計了六組帶有4T1腫瘤的雌性Balb/c小鼠（n=5），分別通過尾靜脈注射方法對其進行治療。每只按照20mg/kg的劑量注射，對照組為PBS，實驗組為PBS+光、CuTz-1@F127、CuTz-1@F127+光、CuTz-1-O2@F127和CuTz-1-O2@F127+光。每2天測量體重和腫瘤大小。圖4a顯示各組小鼠的體重隨著時間的推移逐漸增加，表明這些操作對小鼠的副作用很小。圖4b顯示了隨著時間的推移對腫瘤的治療效果。與對照組相比，CuTz-1@F127和CuTz-1-O2@F127治療組均表現出一定的抑瘤作用。這是因為CuTz-1@F127可以降低腫瘤中GSH的水平（圖4c），從而影響癌細胞的正常生長。CuTz-1@F127+光和CuTz-1-O2@F127+光治療組的腫瘤被有效抑制。此外，由于更多的O2補充，CuTz-1-O2@F127+光組表現出好的腫瘤抑制效果。上述結果表明，載氧MOF治療系統在808nm激光照射下可實現有效腫瘤抑制。治療14d后，處死所有小鼠，切除腫瘤并稱重。圖4d和圖S14顯示，CuTz-1-O2@F127+光組中的腫瘤生長明顯受到抑制，可增強PDT療效。對腫瘤組織進行原位蘇木精和伊紅(H&E)染色，如圖4e所示，在CuTz-1@F127+光和CuTz-1-O2@F127+光組都可以觀察到明顯的腫瘤組織壞死，表明•OH的殺傷力。同時，CuTz-1-O2@F127、CuTz-1@F127+光、CuTz-1-O2@F127+光各處理組和對照組的肝、脾、肺、腎、心臟等主要器官的H&E染色圖像顯示沒有發現明顯的組織損傷（圖S15）。正如預期的那樣，表明CuTz-1-O2@F127具有良好的生物安全性。
圖4
9.體內長期毒性、生物分布和代謝研究
CuTz-1-O2@F127的長期毒性和體內生物分布是通過對Balb/c小鼠進行靜脈注射NPs實現的。如表S1所示，血清生化數據顯示治療組與對照組之間沒有主要參數差異，包括心功能的肌酸激酶（CK）；腎功能的血尿素(BUN)和血清肌酐(CRE)；肝功能的谷丙轉氨酶（ALT），天冬氨酸轉氨酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)。為了確定體內CuTz-1-O2@F127 NPs的生物分布，在尾靜脈注射后定期收集所有小鼠的腫瘤和主要器官。銅濃度用電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS)進行檢測。如圖5a所示，在靜脈注射后的前12小時內，注射的NPs主要被肝臟和脾臟吸收。因為EPR效應，大量NPs可在腫瘤部位蓄積，24h左右達到最大值。然后隨著時間的延長，被檢測器官中的NPs減少。進一步研究了小鼠中NPs的代謝情況，有趣的是，如圖S16和S17所示，SEM和PXRD數據顯示CuTz-1-O2@F127在第五天開始分解。在第10天，CuTz-1-O2@F127*失去了其形態和晶體結構。因此，進一步測量了注射CuTz-1-O2@F127的小鼠在不同時間點收集的糞便和尿液中Cu含量。在早期，肝臟中積累的NPs主要通過膽汁排泄到糞便中，一周后，降解后的NPs可通過腎臟排出，形成尿液（圖5b）。第14天，NPs隨尿液排出達到最大值。此后，排出量逐漸減少，30d后，NPs通過糞便和尿液以90%的高比率排出。這個現象表明雖然CuTz-1在GSH水溶液中穩定，但由于其復雜的TME和可生物降解性，可以排出體外，這極大地證明了CuTz-1-O2@F127的生物降解性。
圖5
結 論
總之，我們開發了用于增強癌癥PDT療效的CuTz-1-O2@F127治療平臺。這種納米級MOF治療劑的制造簡單明了。該研究證明了使用CuTz-1-O2@F127作為潛在的PDT試劑，它具有出色的產生•OH和克服細胞內缺氧的能力，以及降低細胞內GSH水平的能力。盡管對I型PDT機制的闡述，尤其是O2是否起作用，仍有爭議。但體外和體內實驗表明，克服缺氧可以增強PDT療效。更重要的是，一個月后CuTz-1-O2@F127可以通過糞便和尿液以90%的高比率排出小鼠體外，這對于納米醫學在臨床應用方面具有潛在的意義。
索萊寶產品亮點
相關產品
產品名稱 | 產品貨號 |
氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量檢測試劑盒 | BC1180 |
氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量檢測試劑盒 | BC1185 |
谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活性檢測試劑盒 | BC1190 |
谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活性檢測試劑盒 | BC1195 |
谷胱甘肽S-轉移酶(GST)活性檢測試劑盒 | BC0350 |
谷胱甘肽S-轉移酶(GST)活性檢測試劑盒 | BC0355 |
谷胱甘肽還原酶(GR)活性檢測試劑盒 | BC1160 |
谷胱甘肽還原酶(GR)活性檢測試劑盒 | BC1165 |
硫氧還蛋白氧化還原酶(TrxR) 活性檢測試劑盒 | BC1150 |
硫氧還蛋白氧化還原酶(TrxR) 活性檢測試劑盒 | BC1155 |
γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶(GCL) 活性檢測試劑盒 | BC1210 |
γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶(GCL) 活性檢測試劑盒 | BC1215 |
γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GT)活性檢測試劑盒 | BC1220 |
γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GT)活性檢測試劑盒 | BC1225 |
溫馨提示
索萊寶生化試劑盒貨號以“0"、“5"結尾，分別代表兩類反應體系。以“0"結尾的代表試劑盒所用方法為分光光度法(反應體系約1mL)，可以用分光光度計進行檢測；以“5"結尾的試劑盒代表所用方法為微量法(反應體系約0.2mL)，可以用分光光度計或者酶標儀進行檢測。
當前位置：
標準品
